Sự khác biệt giữa trình tự Sanger và Pyroinating

Sự khác biệt chính - Trình tự Sanger vs Pyroinating
 

Trình tự DNA rất quan trọng đối với phân tích DNA vì kiến ​​thức về sự sắp xếp nucleotide chính xác trên một vùng DNA cụ thể cho thấy nhiều thông tin quan trọng về nó. Có nhiều phương pháp giải trình tự DNA khác nhau. Giải trình tự Sanger và Pyroinating là hai phương pháp giải trình tự DNA khác nhau được sử dụng rộng rãi trong Sinh học phân tử. Sự khác biệt chính giữa trình tự Sanger và Pyro do đó là Trình tự Sanger sử dụng dideoxynucleotide để chấm dứt quá trình tổng hợp DNA để đọc trình tự nucleotide trong khi pyro xa phát hiện sự giải phóng pyrophosphate bằng cách kết hợp các nucleotide và tổng hợp trình tự bổ sung để đọc thứ tự chính xác của trình tự.

NỘI DUNG
1. Tổng quan và sự khác biệt chính
2. Trình tự Sanger là gì
3. Pyroinating
4. So sánh cạnh nhau - Trình tự Sanger vs Pyroinating
5. Tóm tắt

Trình tự Sanger là gì?

Giải trình tự Sanger là phương pháp giải trình tự DNA thế hệ đầu tiên được phát triển bởi Frederick Sanger và các trường đại học của ông vào năm 1977. Nó còn được gọi là Trình tự kết thúc chuỗi hoặc là Trình tự Dideoxy vì nó dựa trên sự chấm dứt chuỗi bởi dideoxynucleotide (ddNTPs). Phương pháp này đã được sử dụng rộng rãi trong hơn 30 năm cho đến khi Trình tự thế hệ mới (NGS) được phát triển. Kỹ thuật giải trình tự Sanger cho phép phát hiện thứ tự nucleotide chính xác hoặc đính kèm một đoạn DNA cụ thể. Nó dựa trên sự kết hợp có chọn lọc của ddNTP và chấm dứt tổng hợp DNA trong quá trình trong ống nghiệm Sao chép DNA. Sự vắng mặt của các nhóm 3 'OH để tiếp tục hình thành liên kết phosphodiester giữa các nucleotide liền kề là một tính năng độc đáo của ddNTP. Do đó, một khi ddNTP được gắn vào, việc kéo dài chuỗi chấm dứt và chấm dứt từ thời điểm đó. Có bốn ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP và ddTTP - được sử dụng trong giải trình tự Sanger. Các nucleotide này ngăn chặn quá trình sao chép DNA khi chúng được kết hợp vào chuỗi DNA đang phát triển và dẫn đến các đoạn DNA ngắn khác nhau. Điện di gel mao mạch được sử dụng để tổ chức các chuỗi DNA ngắn này theo kích thước của chúng trên một gel như trong Hình 01.

Hình 1: Điện di gel mao mạch của DNA ngắn tổng hợp

Dành cho trong ống nghiệm sao chép DNA, một số yêu cầu cần được cung cấp. Chúng là enzyme DNA polymerase, DNA mẫu, mồi oligonucleotide và deoxynucleotide (dNTPs). Trong giải trình tự Sanger, sao chép DNA được thực hiện trong bốn ống nghiệm riêng biệt cùng với bốn loại ddNTP riêng biệt. Deoxynucleotide không được thay thế hoàn toàn bởi các ddNTP tương ứng. Một hỗn hợp của dNTP cụ thể (ví dụ: dATP + ddATP) được bao gồm trong ống và được sao chép. Bốn sản phẩm ống riêng biệt được chạy trên một gel trong bốn giếng riêng biệt. Sau đó, bằng cách đọc gel, trình tự có thể được xây dựng như trong Hình 02.

Hình 02: Trình tự Sanger

Giải trình tự Sanger là một kỹ thuật quan trọng giúp ích trong nhiều lĩnh vực sinh học phân tử. Dự án bộ gen người đã được hoàn thành thành công với sự hỗ trợ của các phương pháp dựa trên trình tự Sanger. Giải trình tự Sanger cũng hữu ích trong giải trình tự DNA mục tiêu, nghiên cứu bệnh ung thư và di truyền, phân tích biểu hiện gen, xác định người, phát hiện mầm bệnh, giải trình tự vi khuẩn, v.v..

Có một số nhược điểm của trình tự Sanger:

• Độ dài của DNA được giải trình tự không thể dài hơn 1000 cặp cơ sở
• Mỗi lần chỉ có một chuỗi.
• Quá trình này tốn thời gian và tốn kém.

Do đó, các kỹ thuật giải trình tự tiên tiến mới đã được phát triển theo thời gian để khắc phục những vấn đề này. Tuy nhiên, trình tự Sanger vẫn đang được sử dụng do kết quả có độ chính xác cao lên tới khoảng 850 đoạn dài cặp cơ sở.

Kết quả là gì?

Pyroceedinating là một kỹ thuật giải trình tự DNA mới dựa trên trình tự sắp xếp của bộ tổng hợp bằng cách tổng hợp. Kỹ thuật này dựa trên việc phát hiện sự giải phóng pyrophosphate khi kết hợp nucleotide. Quá trình này được sử dụng bởi bốn loại enzyme khác nhau: DNA polymerse, ATP sulfurylase, luciferase và apyrase và hai cơ chất adenosine 5 'phosphosulfate (APS) và luciferin.

Quá trình bắt đầu với liên kết mồi với mẫu DNA sợi đơn và DNA polymerase bắt đầu kết hợp các nucleotide bổ sung cho nó. Khi các nucleotide kết hợp với nhau (trùng hợp axit nucleic), nó giải phóng các nhóm pyrophosphate (hai nhóm phosphate liên kết với nhau) và năng lượng. Mỗi bổ sung nucleotide giải phóng số lượng pyrophosphate bằng nhau. Pyrophosphate chuyển thành ATP bởi ATP sulfurylase với sự có mặt của chất nền APS. ATP được tạo ra thúc đẩy quá trình chuyển đổi luciferin qua trung gian luciferin thành oxyluciferin, tạo ra ánh sáng khả kiến ​​với số lượng tỷ lệ thuận với lượng ATP. Ánh sáng được phát hiện bởi một thiết bị phát hiện photon hoặc bởi photomultiplier và tạo ra một pyrogram. Apyrase làm suy giảm ATP và các dNTP không kết hợp trong hỗn hợp phản ứng. bổ sung dNTP được thực hiện một lần tại một thời điểm. Vì việc bổ sung nucleotide được biết đến theo sự kết hợp và phát hiện ánh sáng, trình tự của mẫu có thể được xác định. Pyrogram được sử dụng để tạo chuỗi nucleotide của DNA mẫu như trong Hình 03.

Pyroinating là rất quan trọng trong phân tích đa hình đơn nucleotide và giải trình tự các đoạn DNA ngắn. Độ chính xác cao, tính linh hoạt, dễ tự động hóa và xử lý song song là những lợi thế của phương pháp pyro do các kỹ thuật giải trình tự Sanger.

Hình 03: Pyroinating

Sự khác biệt giữa Sanger Sequences và Pyroinating?

Sanger Sequences vs Pyroinating
Giải trình tự Sanger là một phương pháp giải trình tự DNA dựa trên sự kết hợp có chọn lọc của ddNTP bằng DNA polymerase và kết thúc chuỗi.	Pyroinating là một phương pháp giải trình tự DNA dựa trên việc phát hiện sự giải phóng pyrophosphate khi kết hợp nucleotide.
Sử dụng ddNTP
ddNTP được sử dụng để chấm dứt sao chép DNA	ddNTP không được sử dụng.
Enzyme liên quan
DNA polymerase được sử dụng.	Bốn enzyme được sử dụng: DNA polymerase, ATP sulfurylase, Luciferase và Apyrase.
Chất nền được sử dụng
APS và Luciferin không được sử dụng.	Adenosine 5 'phosphosulfate (APS) và luciferin được sử dụng.
Nhiệt độ tối đa
Đây là một quá trình chậm.	Đây là một quá trình nhanh chóng.

Tóm tắt - Sanger Sequences vs Pyroinating

Giải trình tự Sanger và Pyroinating là hai phương pháp giải trình tự DNA được sử dụng trong sinh học phân tử. Trình tự Sanger xây dựng thứ tự các nucleotide theo trình tự bằng cách chấm dứt kéo dài chuỗi trong khi pyro do đó xây dựng thứ tự chính xác của các nucleotide theo trình tự bằng cách kết hợp các nucleotide và phát hiện sự giải phóng pyrophosphate. Do đó, sự khác biệt chính giữa giải trình tự Sanger và Pyro do đó là trình tự Sanger hoạt động trên trình tự bằng cách chấm dứt chuỗi trong khi pyroinating hoạt động trên trình tự tổng hợp.

Tài liệu tham khảo:
1. Fakruddin, Md và Abhijit Chowdhury. Tiết kiệm năng lượng-Thay thế cho trình tự Sanger truyền thống. Tạp chí sinh hóa và công nghệ sinh học Mỹ. Ấn phẩm Khoa học, 02/03/2012. Web. 28 tháng 2 năm 2017.
2. Trình tự Sanger. Trình tự Sanger - Chủ đề ScienceDirect. N.p., n.d. Web. 28 tháng 2 năm 2017

Hình ảnh lịch sự:
1. (D
2. Sanger-DNA-seq, bởi Enzo tại Wikipedia tiếng Ba Lan (CC BY-SA 3.0) qua Commons Wikimedia
3. Truyền dữ liệu trực tuyến bởi vi sinh vật học (CC BY-SA 2.0) qua Flickr